Разработка якорного биспецифичного наноантитела для повышения эффективности иммобилизации и детекции антигена в лунке полистирольного планшета

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Методы иммуноанализа (ИА), проводимые в лунках полистирольного микропланшета, являются основой диагностических исследований. В “сэндвич”-ИА принципиально важным начальным этапом является иммобилизация в лунке планшета якорных антител, предназначенных для специфического связывания заданного антигена из биологической жидкости. Одним из очень перспективных вариантов антиген-узнающих молекул являются однодоменные антитела (наноантитела, НТ). Использование НТ в качестве якорных антител затруднено их низкой эффективностью функционирования после пассивной адсорбции в лунке планшета. Разработка нового формата и способа иммобилизации в случае НТ принципиально важны для преодоления этой проблемы. Данная работа описывает разработку нового формата якорного биспецифичного наноантитела (як-НТ) для повышения эффективности, как пассивной адсорбции як-НТ, так и последующих этапов иммобилизации и детекции целевого антигена в лунке полистирольного планшета.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

С. В. Тиллиб

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: sergei.tillib@gmail.com
Россия, Москва

М. В. Панасюк

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук

Email: sergei.tillib@gmail.com
Россия, Москва

О. С. Горяйнова

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук

Email: sergei.tillib@gmail.com
Россия, Москва

Т. И. Иванова

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук

Email: sergei.tillib@gmail.com
Россия, Москва

Список литературы

  1. Crowther J.R. Methods in Molecular Biology, The ELISA Guidebook. Second Edition. Humana Press, a part of Springer Science + Business Media, LLC 2009.
  2. Hayrapetyan H., Tran T., Tellez-Corrales, E., et al. (2023). Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: Types and Applications. PP 1-17. In: Matson, R.S. (eds) ELISA. Methods in Molecular Biology, vol. 2612. Humana, New York, NY.
  3. Hamers-Casterman C, Atarhouch T., Muyldermans S., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature, 1993, vol. 363, no. 6428, pp. 446–448.
  4. Тиллиб С.В. Перспективы использования однодоменных антител в биомедицине. Молекулярная биология 2020, Т. 54, № 3, С. 362–373.
  5. Tillib S.V., Privezentseva M.E., Ivanova T.I., et al. Single-domain antibody-based ligands for immunoaffinity separation of recombinant human lactoferrin from the goat lactoferrin of transgenic goat milk. Journal of Chromatography B, 2014, vol. 949-950, pp. 48–57.
  6. Горяйнова О. С., Иванова Т.И., Рутовская М.В., и др. Метод параллельного и последовательного генерирования однодоменных антител для протеомного анализа плазмы крови человека. Молекулярная биология, 2017, т. 51, № 6, с. 985–996.
  7. Горяйнова О.С., Хан Е.О., Иванова Т.И., и др. Новый метод, базирующийся на использовании иммобилизованных однодоменных антител для удаления определенных мажорных белков из плазмы крови, способствует уменьшению неспецифического сигнала в иммуноанализе. Медицинская иммунология 2019, Т. 21, № 3, С. 567–575.
  8. Li D., Morisseau C., McReynolds C.B., et al. Development of Improved Double-Nanobody Sandwich ELISAs for Human Soluble Epoxide Hydrolase Detection in Peripheral Blood Mononuclear Cells of Diabetic Patients and the Prefrontal Cortex of Multiple Sclerosis Patients. Anal Chem., 2020, vol. 92, no. 10, pp. 7334–7342.
  9. Tillib S.V., Goryainova O.S. Extending Linker Sequences between Antigen-Recognition Modules Provides More Effective Production of Bispecific Nanoantibodies in the Periplasma of E. coli. Biochemistry (Mosc)., 2024, vol. 89, no. 5, pp. 933–941.
  10. Levay P., Viljoen M. Lactoferrin: A general review. Haematologica, 1994, vol. 80, pp. 252–267.
  11. Guo Y.C., Zhou Y.F., Zhang X.E., et al. Phage display mediated immuno-PCR. Nucleic Acids Res. 2006, vol. 34, no. 8, e62.
  12. Holland P.M., Abramson R.D., Watson R., et al. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5’-3’ exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA., 1991, vol.;88, no.16, pp.7276–7280.
  13. Deng Y., Liu J., Lu Y., et al. Novel Polystyrene-Binding Nanobody for Enhancing Immunoassays: Insights into Affinity, Immobilization, and Application Potential. Anal Chem., 2024, vol. 96, no. 4, pp. 1597–1605.
  14. Qiang X., Sun K., Xing L., et al. Discovery of a polystyrene binding peptide isolated from phage display library and its application in peptide immobilization. Sci Rep. ,2017, vol. 7, no. 1, 2673.
  15. Kumada Y., Kuroki D., Yasui H., et al. Characterization of polystyrene-binding peptides (PS-tags) for site-specific immobilization of proteins. J Biosci Bioeng., 2010, vol. 109, no. 6, pp.583–587.
  16. .Kumada Y., Hamasaki K., Shiritani Y., et al. Efficient immobilization of a ligand antibody with high antigen-binding activity by use of a polystyrene-binding peptide and an intelligent microtiter plate. J. Biotechnol., 2009, vol.142, pp. 135–141.
  17. Feng B., Dai Y., Wang L., et al. A novel affinity ligand for polystyrene surface from a phage display random library and its application in anti-HIV-1 ELISA system. Biologicals., 2009, vol. 37, no. 1, pp. 48–54.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Свойства двух однодоменных антител (як-5 и як-7), высокоаффинно связывающих полистирол, отобранных методом фагового дисплея. В верхней части рисунка представлены усредненные результаты ускоренного иммуноферментного анализа связывания с пустыми (без предварительной блокировки) и блокированными 1% БСА лунками полистирольного планшета (MaxiSorp, Nunc) двух новых “липких” НТ, як-5 и як-7, а также ранее полученного контрольного НТ против лактоферрина человека (аLF-6). Контролем являлись также лунки без НТ. Вертикальными отрезками показаны области разброса данных трех параллельных экспериментов. В таблице 1 указаны некоторые свойства отобранных НТ и аминокислотные последовательности их гипервариабельных участков.

Скачать (26KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Создание и использование для детекции антигена (чЛФ) нового якорного биспецифического наноантитела LF6-L1-як7. (А) Схема используемой экспрессионной конструкции для синтеза биспецифичных нанотел. Слева направо в конструкции обозначены: лактозный промоторный участок (Plac/operator); участок связывания с рибосомой (RBS); начало транскрипции (стрелка); сигнальный пептид для периплазматической локализации (pelB); последовательности, кодирующие нанотела (aLF-6 и як-7), разделенные линкерной последовательностью L1 [9]; последовательности HA-тага (YPYDVPDYA) и шесть остатков гистидина на самом конце. (Б) – Электрофоретическое разделение в 5-19% градиентном SDS-полиакриламидном геле белков аффинно очищенных нанотел. Стрелкой показано положение биспецифичных нанотел (бс-НТ) и для сравнения нанесено очищенное мономерное нанотело aLF-6 (НТ). (В) Калибровочная кривая для детекции лактоферрина человека (чЛФ), построенная на усредненных данных подсчета колоний, получаемых на основе разработанного сэндвич-иммуноанализа с якорным биспецифическим наноантителом (LF6-L1-як7) и детектирующим наноантителом aLF-5, экспонированного на поверхности рекомбинантного бактериофага M13. Черными кружками обозначены усредненные данные, полученные для разных концентраций чЛФ (0, 0.5, 1, 2, 4, 8 и 16 нг/мл). Звездочкой обозначены усредненные данные определения чЛФ в образце разведенной плазмы крови человека (закрашенная черным звездочка соответствует данным заметного увеличения детектируемого чЛФ в результате предобработки плазмы с целью диссоциации возможных комплексов детектируемого антигена с другими компонентами).

Скачать (66KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025