Фоторасщепляемые направляющие РНК для фоторегулируемой системы CRISPR/Cas9

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Создание систем редактирования генома на основе CRISPR/Cas с повышенной эффективностью и специфичностью, а также возможностью регуляции действия путем облучения светом представляет собой актуальную задачу. Перспективный способ решения этой задачи – модификация компонентов систем CRISPR/Cas, в частности направляющих РНК, путем введения фоторасщепляемых линкеров. Мы разработали подход к получению фоторасщепляемых направляющих sgРНК (single guide RNA) для системы CRISPR/Cas9, содержащих линкеры на основе 1-(2-нитрофенил)-1,2-этандиола. При облучении УФ-светом такие направляющие РНК разрушаются, и происходит “выключение” системы CRISPR/Cas9. Нами получено три варианта фотомодифицированных sgРНК с различным расположением фотолинкера. Показано, что sgРНК, в которой фотолинкер расположен в области связывания с белком Cas9 и формирования шпильки, способна эффективно направлять белок Cas9 для расщепления ДНК-мишени до облучения УФ-светом и утрачивает свою активность после облучения. Выбраны условия для контролируемого расщепления 40% модельной ДНК-мишени. Разработанный подход обеспечивает специфическую инактивацию системы геномного редактирования CRISPR/Cas9 в заданный момент времени в определенном месте. Фоторегуляция геномного редактирования позволит не только снизить нежелательные нецелевые эффекты, но также может стать основой для лечения ряда генетических заболеваний.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Е. А. Ахметова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: danov@niboch.nsc.ru
Россия, 630090 Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8

И. П. Вохтанцев

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский государственный университет

Email: danov@niboch.nsc.ru
Россия, 630090 Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8; 630090 Новосибирск, ул. Пирогова, 1

М. И. Мещанинова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: danov@niboch.nsc.ru
Россия, 630090 Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8

М. А. Воробьева

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: danov@niboch.nsc.ru
Россия, 630090 Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8

Д. О. Жарков

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский государственный университет

Email: danov@niboch.nsc.ru
Россия, 630090 Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8; 630090 Новосибирск, ул. Пирогова, 1

Д. С. Новопашина

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: danov@niboch.nsc.ru
Россия, 630090 Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8; 630090 Новосибирск, ул. Пирогова, 1

Список литературы

  1. Wang J.Y., Pausch P., Doudna J.A. // Nat. Rev. Microbiol. 2022. V. 20. P. 641–656. https://doi.org/10.1038/s41579-022-00739-4
  2. Makarova K.S., Wolf Y.I., Iranzo J., Shmakov S.A., Alkhnbashi O.S., Brouns S.J.J., Charpentier E., Cheng D., Haft D.H., Horvath P., Moineau S., Mojica F.J.M., Scott D., Shah S.A., Siksnys V., Terns M.P., Venclovas Č., White M.F., Yakunin A.F., Yan W., Zhang F., Garrett R.A., Backofen R., van der Oost J., Barrangou R., Koonin E.V. // Nat. Rev. Microbiol. 2020. V. 18. P. 67–83. https://doi.org/10.1038/s41579-019-0299-x
  3. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. // Science. 2012. V. 337. P. 816–821. https://doi.org/10.1126/science.1225829
  4. Wang J.Y., Doudna J.A. // Science. 2023. V. 379. P. 8643. https://doi.org/10.1126/science.add8643
  5. Li T., Yang Y., Qi H., Cui W., Zhang L., Fu X., He X., Liu M., Li P.-F., Yu T. // Sig. Transduct. Target. Ther. 2023. V. 8. P. 36. https://doi.org/10.1038/s41392-023-01309-7
  6. Filippova J., Matveeva A., Zhuravlev E., Stepanov G. // Biochimie. 2019. V. 167. P. 49–60. https://doi.org/10.1016/j.biochi.2019.09.003
  7. Liu Y., Zou R.S., He S., Nihongaki Y., Li X., Razavi S., Wu B., Ha T. // Science. 2020. V. 368. P. 1265–1269. https://doi.org/10.1126/science.aay8204
  8. Jain P.K, Ramanan V., Schepers A.G., Dalvie N.S., Panda A., Fleming H.E., Bhatia S.N. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2016. V. 55. P. 12440–12444. https://doi.org/10.1002/anie.2016061
  9. Zhou W., Brown W., Bardhan A., Delaney M., Ilk A.S., Rauen R.R., Kahn S.I., Tsang M., Deiters A. // Angew. Chem. Int. Ed. 2020. V. 59. P. 8998–9003. https://doi.org/10.1002/anie.201914575
  10. Sun Y.-J., Chen W.-D., Liu J., Li J.-J., Zhang Y., Cai W.-Q., Liu L., Tang X.-J., Hou J., Wang M., Cheng. L. // Angew. Chem. Int. Ed. 2023. V. 2. P. e202212413. https://doi.org/10.1002/anie.202212413
  11. Zetsche B., Volz S.E., Zhang F. // Nat. Biotechnol. 2015. V. 33. P. 139–142. https://doi.org/10.1038/nbt.3149
  12. Nihongaki Y., Kawano F., Nakajima T., Sato M. // Nat. Biotechnol. 2015. V. 33. P. 755–760. https://doi.org/10.1038/nbt.3245
  13. Chen Y., Liu X., Zhang Y., Wang H., Ying H., Liu M., Li D., Lui K.O., Ding Q. // Mol. Ther. 2016. V. 24. P. 1508–1510. https://doi.org/10.1038/mt.2016.172
  14. Petris G., Casini A., Montagna C., Lorenzin F., Prandi D., Romanel A., Zasso J., Conti L., Demichelis F., Cereseto A. // Nat. Commun. 2017. V. 8. P. 15334. https://doi.org/10.1038/ncomms15334
  15. Akhmetova E.A., Golyshev V.M., Vokhtantsev I.P., Meschaninova M.I., Venyaminova A.G., Novopashina D.S. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2021. V. 47. P. 496–504. https://doi.org/10.1134/S1068162021020023
  16. Nishimasu H., Ran F.A., Hsu P.D., Konermann S., Shehata S.I., Dohmae N., Ishitani R., Zhang F., Nureki O. // Cell. 2014. V. 156. P. 935–949. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.02.001
  17. Jiang F., Doudna J.A. // Ann. Rev. Biophysics. 2017. V. 46. P. 505–529. https://doi.org/10.1146/annurev-biophys-062215-010822
  18. Anders C., Jinek M. // Methods Enzymol. 2014. V. 546. P. 1–20. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-5
  19. Shubsda M.F., Goodisman J., Dabrowiak J.C. // J. Biochem. Biophys. Methods. 1997. V. 34. P. 73–79. https://doi.org/10.1016/S0165-022X(96)01204-3
  20. Setlow R.B. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. V. 71. P. 3363–3366. https://doi.org/10.1073/pnas.71.9.3363
  21. Mullenders L.H.F. // Photochem. Photobiol. Sci. 2018. V. 17. P. 1842–1852. https://doi.org/10.1039/c8pp00182k

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Расщепление плазмиды pBluescriptII SK(−) системой CRISPR/Cas9. (а) – Схематическое изображение комплекса ДНК-мишени и немодифицированной sgРНК с белком Cas9 и последовательности фотолабильных направляющих РНК sgRNA-PL1, sgRNA-PL2 и sgRNA-PL3; (б) – электрофоретический анализ продуктов расщепления в 1%-ном агарозном геле. М – маркер длины ДНК, К⁻ – исходная кольцевая суперскрученная плазмидная ДНК-мишень, содержащая незначительное количество ДНК в релаксированной форме; К⁺ – продукты расщепления ДНК-мишени в присутствии немодифицированной химически синтезированной 102-звенной sgRNA; остальные дорожки – анализ продуктов расщепления ДНК-мишени в присутствии облученных (+UV) и необлученных (–UV) фотолабильных направляющих РНК (sgRNA-PL1, sgRNA-PL2 или sgRNA-PL3). Время реакции 60 мин, температура 37°C. Условия проведения реакции см. в “Эксперим. части”.

Скачать (463KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Анализ эффективности расщепления дцДНК-мишени системой CRISPR/Cas9, содержащей фотолабильные направляющие РНК, до и после облучения. Условия расщепления см. в “Эксперим. части”. Данные получены усреднением результатов не менее трех независимых экспериментов.

Скачать (109KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Электрофоретический анализ продуктов расщепления плазмиды pBluescriptII SK(−) в присутствии фрагментов sgРНК в 1%-ном агарозном геле. М – маркер длины ДНК, К⁻ – исходная кольцевая суперскрученная плазмидная ДНК-мишень, содержащая незначительное количество ДНК в релаксированной форме; K+ – продукт расщепления ДНК-мишени в присутствии немодифицированной химически синтезированной sgРНК; (а) – sgRNA-PL2 – продукты расщепления ДНК-мишени в присутствии 5ʹfr_sgRNA-PL2 и 3ʹfr_sgRNA-PL2 (5ʹfr +3ʹfr) или только 5ʹfr_sgRNA-PL2 (5ʹfr); (б) – sgRNA-PL3 (69) – продукты расщепления ДНК-мишени в присутствии 69-звенного 5ʹ-фрагмента sgRNA-PL3; (в) – анализ эффективности расщепления плазмиды нуклеазой Cas9 в присутствии фрагментов sgРНК. Условия расщепления см. в “Эксперим. части”. Данные получены усреднением результатов не менее двух независимых экспериментов.

Скачать (291KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Кинетические кривые расщепления ДНК-мишени комплексами Cas9 с направляющими немодифицированными РНК, полученные путем обработки данных электрофоретического анализа реакционных смесей в агарозном геле с визуализацией бромистым этидием. Условия расщепления см. в “Эксперим. части”. Данные получены усреднением результатов не менее трех независимых экспериментов.

Скачать (111KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Кинетические кривые расщепления ДНК-мишени комплексом белка Cas9 с sgRNA-PL2. 1 – контрольная РНК (sgRNA), 2 – фоточувствительная РНК (sgRNA-PL2), 3 – дезактивированная фоточувствительная РНК в комплексе с Cas9, 4 – остановка реакции УФ-облучением (30 мин) с 5-й минуты от начала реакции, 5 – остановка реакции УФ-облучением (5 мин) с 5-й минуты от начала реакции, 6 – дезактивированная вне комплекса с Cas9 фоточувствительная РНК. Условия расщепления см. в “Эксперим. части”. Данные получены усреднением результатов не менее трех независимых экспериментов.

Скачать (132KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024