Экспрессия внеклеточного фрагмента PD-L1 мыши и получение антител к PD-L1

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Ряд молекул, экспрессированных на клетках млекопитающих, вовлечен в формирование аутотолерантности. К ним, в первую очередь, относятся CTLA-4/B7 и PD1-PD-L1 сигнальные пути. Блокаторы этих сигнальных путей, называемые ингибиторами контрольных точек (ИКТ) иммунитета, используются в клинике для терапии разных форм рака. Антитела к CTLA-4 вызывают системную токсичность и одобрены только для для терапии некоторых форм рака. Антитела против PD1 или PD-L1 успешно применяются для терапии разных типов рака и характеризуются незначительной токсичностью. Однако ответ на терапию с использованием ИКТ наблюдается не во всех случаях. Разработка более эффективных подходов к терапии рака на основе PD1/PD-L1 ингибиторов требует дополнительных исследований. Целью данной работы была экспрессия внеклеточной части белка PD-L1 мыши (exPD-L1) и получение антител к PD-L1. В бактериальной системе экспрессии был получен и охарактеризован белок exPD-L1 мыши. Белок exPD-L1 использовали для иммунизации мышей с целью получения продуцентов анти-PD-L1 антител. С помощью гибридомной технологии получено 5 клонов, экспрессирующих антитела к exPD-L1. Антитела клона В12 были наработаны в асцитной жидкости мышей линии BALB/c и очищены методом аффинной хроматографии. Методом ИФА для очищенных антител было показано специфичное связывание с белком exPD-L1 и коммерческим белком внеклеточной части мышиного PD-L1. Эксперименты методами проточной цитометрии и конфокальной микроскопии показали, что полученные антитела связывают внутриклеточную форму белка PD-L1, в отличие от коммерческих антител, связывающих мембранную форму.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

М. C. Горюнова

ФГБУН ГНЦ “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН

Email: esvir@mail.ibch.ru
Россия, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

Д. Ю. Рязанцев

ФГБУН ГНЦ “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН

Email: esvir@mail.ibch.ru
Россия, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

Е. Э. Петрова

ФГБУН ГНЦ “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН

Email: esvir@mail.ibch.ru
Россия, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

В. В. Костенко

ФГБУН ГНЦ “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН; ФГБУО ВО “Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова”

Email: esvir@mail.ibch.ru
Россия, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; 119991 Москва, Ленинские горы, 1

А. О. Макарова

ФГБУН ГНЦ “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН; ФГБУО ВО “Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова”

Email: esvir@mail.ibch.ru
Россия, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; 119991 Москва, Ленинские горы, 1

Р. В. Холоденко

ФГБУН ГНЦ “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН

Email: esvir@mail.ibch.ru
Россия, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

Е. В. Рябухина

ФГБУН ГНЦ “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН

Email: esvir@mail.ibch.ru
Россия, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

Д. В. Калиновский

ФГБУН ГНЦ “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН

Email: esvir@mail.ibch.ru
Россия, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

О. Д. Коцарева

ФГБУН ГНЦ “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН

Email: esvir@mail.ibch.ru
Россия, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

Е. В. Свирщевская

ФГБУН ГНЦ “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: esvir@mail.ibch.ru
Россия, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

Список литературы

  1. Zhang H., Dai Z., Wu W., Wang Z., Zhang N., Zhang L., Zeng W.J., Liu Z., Cheng Q. // J. Exp. Clin. Cancer Res. 2021. V. 40. P. 184. https://doi.org/10.1186/s13046-021-01987-7
  2. Murphy T.L., Murphy K.M. // Cell. Mol. Immunol. 2022. V. 19. P. 3–13. https://doi.org/10.1038/s41423-021-00741-5
  3. De Felice F., Marchetti C., Tombolini V., Panici P.B. // Int. J. Clin. Oncol. 2019. V. 24. P. 910–916. https://doi.org/10.1007/s10147-019-01437-7
  4. De Felice F., Marchetti C., Palaia I., Ostuni R., Muzii L., Tombolini V., Benedetti Panici P. // Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2018. V.129. P. 40–43. https://doi.org/10.1016/j.critrevonc.2018.06.006
  5. De Felice F., Pranno N., Marampon F., Musio D., Salducci M., Polimeni A., Tombolini V. //Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2019. V. 138. P. 60–69. https://doi.org/10.1016/j.critrevonc.2019.03.019
  6. Honda T., Egen J.G., Lämmermann T., Kastenmüller W., Torabi-Parizi P., Germain R.N. // Immunity. 2014. V. 40. P. 235–247. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2013.11.017
  7. Huang G., Wen Q., Zhao Y., Gao Q., Bai Y. // PLoS One. 2013. V. 8. P. e61602. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061602
  8. Boussiotis V.A.//N. Engl. J. Med. 2016. V. 375. P. 1767–1778. https://doi.org/10.1056/NEJMra1514296
  9. Jin Y., Wei J., Weng Y., Feng J., Xu Z., Wang P., Cui X., Chen X., Wang J., Peng M. //Front Oncol. 2022. V. 12. P. 732814. https://doi.org/10.3389/fonc.2022.732814
  10. Dong H., Strome S.E., Salomao D.R., Tamura H., Hirano F., Flies D.B., Roche P.C., Lu J., Zhu G., Tamada K., Lennon V.A., Celis E., Chen L. // Nat. Med. 2002. V. 8. P. 793–800. https://doi.org/10.1038/nm730
  11. Sun C., Mezzadra R., Schumacher T.N. // Immunity. 2018. V. 48. P. 434–452. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2018.03.014
  12. Horn L., Mansfield A.S., Szczęsna A., Havel L., Krzakowski M., Hochmair M.J., Huemer F., Losonczy G., Johnson M.L., Nishio M., Reck M., Mok T., Lam S., Shames D.S., Liu J., Ding B., Lopez-Chavez A., Kabbinavar F., Lin W., Sandler A., Liu S.V., IMpower133 Study Group. // N. Engl. J. Med. 2018. V. 379. P. 2220–2229. https://doi.org/10.1056/NEJMoa1809064
  13. D’Angelo S.P., Lebbé C., Mortier L., Brohl A.S., Fazio N., Grob J.J., Prinzi N., Hanna G.J., Hassel J.C., Kiecker F., Georges S., Ellers-Lenz B., Shah P., Güzel G., Nghiem P. // J. Immunother. Cancer. 2021. V. 9. P. e002646. https://doi.org/10.1136/jitc-2021-002646
  14. Ascierto P.A., Del Vecchio M., Mandalá M., Gogas H., Arance A.M., Dalle S., Cowey C.L., Schenker M., Grob J.J., Chiarion-Sileni V., Márquez-Rodas I., Butler M.O., Maio M., Middleton M.R., de la Cruz-Merino L., Arenberger P., Atkinson V., Hill A., Fecher L.A., Millward M., Khushalani N.I., Queirolo P., Lobo M., de Pril V., Loffredo J., Larkin J., Weber J. // Lancet Oncol. 2020. V. 21. P. 465–1477. https://doi.org/10.1016/S1470-2045(20)30494-0
  15. Brooker R.C., Schache A.G., Sacco J.J. // Br. J. Oral. Maxillofac. Surg. 2021. V. 59. P. 959–962. https://doi.org/10.1016/j.bjoms.2020.08.059
  16. Li H.Y., McSharry M., Bullock B., Nguyen T.T., Kwak J., Poczobutt J.M., Sippel T.R., Heasley L.E., Weiser-Evans M.C., Clambey E.T., Nemenoff R.A. // Cancer Immunol Res. 2017. V. 5. P. 767–777. https://doi.org/10.1158/2326-6066.CIR-16-0365
  17. Denis M., Grasselly C., Choffour P.A., Wierinckx A., Mathé D., Chettab K., Tourette A., Talhi N., Bourguignon A., Birzele F., Kress E., Jordheim L.P., Klein C., Matera E.L., Dumontet C. // Cancer Immunol. Res. 2022. V. 10. P. 1013–1027. https://doi.org/10.1158/2326-6066
  18. Lin H., Wei S., Hurt E.M., Green M.D., Zhao L., Vatan L., Szeliga W., Herbst R., Harms P.W., Fecher L.A., Vats P., Chinnaiyan A.M., Lao C.D., Lawrence T.S., Wicha M., Hamanishi J., Mandai M., Kryczek I., Zou W. // J. Clin. Invest. 2018. V. 128. P. 805–815. https://doi.org/10.1172/JCI96113
  19. Allen E., Jabouille A., Rivera L.B., Lodewijckx I., Missiaen R., Steri V., Feyen K., Tawney J., Hanahan D., Michael I.P., Bergers G. //Sci. Transl. Med. 2017. V. 9. P. eaak9679. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aak9679
  20. Juneja V.R., McGuire K.A., Manguso R.T., LaFleur M.W., Collins N., Haining W.N., Freeman G.J., Sharpe A.H. // J. Exp. Med. 2017. V. 214. P. 895–904. https://doi.org/10.1084/jem.20160801
  21. Gao Y., Nihira N.T., Bu X., Chu C., Zhang J., Kolodziejczyk A., Fan Y., Chan N.T., Ma L., Liu J., Wang D., Dai X., Liu H., Ono M., Nakanishi A., Inuzuka H., North B.J., Huang Y.H., Sharma S., Geng Y., Xu W., Liu X.S., Li L., Miki Y., Sicinski P., Freeman G.J., Wei W. // Nat. Cell Biol. 2020. V. 22. P. 1064–1075. https://doi.org/10.1038/s41556-020-0562-4
  22. Yu J., Zhuang A., Gu X., Hua Y., Yang L., Ge S., Ruan J., Chai P., Jia R., Fan X. // Cell Discov. 2023. V. 9. P. 33. https://doi.org/10.1038/s41421-023-00521-7
  23. Qu L., Jin J., Lou J., Qian C., Lin J., Xu A., Liu B., Zhang M., Tao H., Yu W. // Cancer Immunol. Immunother. 2022. V. 71. P. 2313–2323. https://doi.org/10.1007/s00262-022-03176-7
  24. Garcia-Diaz A., Shin D.S., Moreno B.H., Saco J., Escuin-Ordinas H., Rodriguez G.A., Zaretsky J.M., Sun L., Hugo W., Wang X., Parisi G., Saus C.P., Torrejon D.Y., Graeber T.G., Comin-Anduix B., Hu-Lieskovan S., Damoiseaux R., Lo R.S., Ribas A. // Cell Rep. 2017. V. 19. P. 1189–1201. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.04.031
  25. Hsu J.M., Li C.W., Lai Y.J., Hung M.C. // Cancer Res. 2018. V. 78. P. 6349–6353. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-18-1892
  26. Li C.W., Lim S.O., Chung E.M., Kim Y.S., Park A.H., Yao J., Cha J.H., Xia W., Chan L.C., Kim T., Chang S.S., Lee H.H., Chou C.K., Liu Y.L., Yeh H.C., Perillo E.P., Dunn A.K., Kuo C.W., Khoo K.H., Hsu J.L., Wu Y., Hsu J.M., Yamaguchi H., Huang T.H., Sahin A.A., Hortobagyi G.N., Yoo S.S., Hung M.C. // Cancer Cell. 2018. V. 33. P. 187.e10–201.e10. https://doi.org/10.1016/j.ccell.2018.01.009

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Экспрессия белка exPD-L1. (а) – Анализ экспрессии гена exPD-L1 в линиях клеток мышей; (б) – схема экспрессионного вектора pQE30, включающего ген белка exPD-L1; (в) – электрофореграмма результатов ПЦР фрагмента гена, кодирующего exPD-L1 до клонирования (1) и после встраивания в промежуточную плазмиду pTZ57R/T (2); (г) – электрофореграмма результатов выделения и очистки белка exPD-L1. (3) – лизат E. coli, который наносили на колонку с Ni-NTA агарозой; (4) – проскок с колонки; (5) – фракция промывки колонки от неспецифично связавшихся белков; (6) – фракция элюции (помимо целевого белка видны продукты его деградации); (7) – образец раствора белка после проведения обращенно-фазовой хроматографии; (8) – образец раствора белка после проведения рефолдинга белка и его диализа; M – маркер молекулярного веса белков и ДНК.

Скачать (211KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Характеристика моноклональных антител к exPD-L1, продуцируемых полученными гибридомами. (а) – Связывание белка exPD-L1 антителами из культуральной жидкости полученных гибридом методом ИФА; (б) – распознавание белков внеклеточной части PD-L1 (exPD-L1 и RPA788Mu01) и белка сравнения (ДНК-полимераза фага Phi29 с 6xHis тагом) мАт, выделенными из асцитной жидкости гибридомы B12; (в) – электрофореграммы белка RPA788Mu01 и (г) очищенных мАт В12 в восстанавливающих и невосстанавливающих (слева направо) условиях; (д) – изотипирование мАт, секретируемых полученными гибридомами; (е) – распознавание мАт гибридомы В12 в дот-блоте ДНК-полимеразы фага Phi29-6xHis (1), exPD-L1 (2) и RPA788Mu01 (3) (слева направо уменьшающаяся концентрация белка); (ж) – электрофореграммы и вестерн-блот лизатов клеток мыши B16/F10 (1, 3, 5) и человека SCOV-3 (2, 4, 6), меченные антителами В12 против PD-L1 мыши (3, 4) и против двух форм белка теплового шока 70 (конститутивная и индуцируемая формы) (5, 6); (з) – гистограммы распределения живых клеток EL-4, окрашенных B12-Cy3 и (и) 10F.9G2-PE. Розовым цветом отмечены контрольные гистограммы, голубым отмечены клетки после связывания с антителами; (к) – дот-плоты живых и (л) пермиабилизованных клеток B16/F10, (ж, абсцисса) – меченных B12 или 10F.9G2 (ордината). Розовым цветом отмечены контрольные гистограммы, голубым отмечены клетки после связывания с антителами.

Скачать (345KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Анализ локализации PD-L1 в клетках B16/F10, культивированных в 3D условиях. Клетки инкубировали на антиадгезивной подложке 20 ч без (а, б) и с добавлением IFN-γ мыши (в, г), фиксировали, перфорировали и окрашивали антителами В12 (а, в) или 10F.9G2 (б, г). На врезках показаны увеличенные изображения отдельных клеток. Зеленой стрелкой отмечена плазматическая мембрана клеток, синей – ядерная мембрана. Синим окрашены ядра клеток (б, г). Шкала 7–9 мкм.

Скачать (485KB)
Метаданные
5. Таблица 3. Гомология белков PD-L1 мыши (mecPD-L1) и человека (hPD-L1)*

Скачать (642KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024