Молекулярная биология

Рак молочной железы (РМЖ) – мультифакторное заболевание, которое характеризуется различными генетическими и эпигенетическими изменениями, возникающими, в том числе, под действием внешнесредовых этиологических факторов. Получены убедительные данные, свидетельствующие об участии эпигенетической дерегуляции в патогенезе РМЖ. В число потенциальных предикторов риска РМЖ могут входить различные микроРНК (миРНК), регулирующие широкий спектр биологических процессов в клетке. Понимание функциональной роли этих молекул даст ценную информацию о сложных молекулярных механизмах, лежащих в основе возникновения и прогрессирования РМЖ. В представленном обзоре с использованием опубликованных данных и биоинформатического анализа суммированы представления об аберрантной экспрессии miR-125b, miR-181a и miR-16 при РМЖ, рассмотрена их роль в патогенезе РМЖ, выполнена аннотация целевых генов-мишеней, оценен репрессионный потенциал миРНК и их диагностическая значимость при РМЖ. Рассмотрена экспрессия этих миРНК в различных типах клеток человека, подвергнутых радиационному воздействию. Интерес к конкретным миРНК обусловлен результатами многолетнего мониторинга здоровья людей, проживавших на радиоактивно-загрязненных территориях Южного Урала, а также данными о профилях экспрессии miR-125b, miR-181a и miR-16 в отдаленный период у облученных людей.

Одной из причин возникновения сердечно-сосудистых заболеваний является воздействие генетических факторов тромбогенного риска. Нарушения в генах системы гемостаза и фолатного цикла могут приводить к развитию таких патологических состояний, как инфаркты, инсульты, тромбоэмболии, кровотечения, осложнения послеоперационного периода. Раннее выявление клинически значимых полиморфизмов в генах, обуславливающих предрасположенность к тромбогенным заболеваниям, позволяет осуществлять профилактику и диагностику заболевания еще до развития клинической картины, а также подбирать персонифицированную схему лечения и определять риск развития осложнений, связанных с применением лекарственных препаратов. В представленной работе разработан набор “SNP2-TMG”, предназначенный для выявления 10 генетических маркеров предрасположенности к тромбогенным заболеваниям (rs1801131, rs6025, rs11549465, rs429358, rs7412, rs1799963, rs6050, rs1799762, rs2010963, rs1801133) методом минисеквенирования с использованием технологии SNaPshot. Этот набор прошел клинические испытания и разрешен к использованию как изделие медицинского назначения.

Достижения в области редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas открыли новые возможности для лечения многих заболеваний человека, включая ВИЧ-инфекцию. Нокаут гена CCR5, как потенциальный способ лечения ВИЧ-инфекции, изучается уже давно. Проанализированы ранее изученные направляющие (гидовые) РНК нуклеаз SpCas9 и AsCas12a, нацеленные на ген CCR5, и отобраны наиболее эффективные из них. С использованием биоинформатических подходов проведен поиск новых гидовых РНК этих же нуклеаз. Сравнили эффективность расщепления целевых сайтов нуклеазами SpCas9, SpCas9-HF1-plus и AsCas12a в комплексе с выбранными гидовыми РНК, а также их нецелевую активность. Показано, что две из протестированных гидовых РНК для SpCas9-HF1-plus и три для AsCas12a обеспечили разрезание гена CCR5 в 60–72% клеток, при этом их нецелевая активность находилось ниже предела детекции. Таким образом, эти гидовые РНК можно рассматривать в качестве кандидатов для разработки подходов генной терапии ВИЧ-инфекции.

Одним из многообещающих новых подходов к лечению ВИЧ-инфекции является CRISPR/Cas-опосредованный нокаут гена рецептора CCR5 с последующей интеграцией антиВИЧ-гена в область разрыва. Нокауту гена CCR5 посвящено множество работ, однако эффективность последующей таргетной интеграции протяженных фрагментов остается недостаточно изученной. Чтобы оценить эффективность этого подхода, мы изучили встраивание кассеты, экспрессирующей ген EGFP, в локус CCR5 с использованием двух разных нуклеаз (SpCas9 и AsCpf1) и различных вариантов донорной ДНК, доставляемой в составе рекомбинантных аденоассоциированных вирусных векторов (rAAV). Для каждой из нуклеаз были сконструированы пять вариантов донорной ДНК, отличающихся длиной плеч гомологии (от 150 до 1000 п.н.) или их структурой. Эффективность интеграции трансгена с плечами гомологии 150 п.н. оказалась самой низкой при использовании обеих нуклеаз и достоверно отличалась от конструкций с более длинными плечами гомологии. Также показано, что наличие в донорной ДНК сайтов разрезания нуклеазы, фланкирующих кассету с плечами гомологии, не влияет на эффективность интеграции трансгена при AAV-доставке. Максимальная эффективность встраивания (59 ± 6%) достигнута при использовании нуклеазы AsCpf1 и экспрессионной кассеты с плечами гомологии длиной 600 п.н.

Неупорядоченные белки или регионы белков характеризуются отсутствием четко выраженной трехмерной конформации. Их часто называют внутренне неупорядоченными белками или областями, но при этом они играют важную роль в различных клеточных процессах и связаны с развитием ряда патологий. В in silico исследовании мы изучили белковые комплексы, состоящие как из упорядоченного белка 14-3-3γ, так и белков с внутренне неупорядоченными областями: белка нуклеокапсида (N) SARS-CoV-2 и p53. Показано, что комплексы, смоделированные с помощью AlphaFold2 и прошедшие этап улучшения с использованием дискретного молекулярно-динамического моделирования, приобретают определенную структуру в неупорядоченных областях. Этот процесс помогает решить одну из ключевых проблем в исследовании неупорядоченных белков – их склонность избегать стабильных конформаций.

Принято считать, что существующий набор протеиногенных аминокислот, кодируемых стандартным генетическим кодом, сформировался поэтапно в ходе эволюции. В большинстве исследований в число ранних входят Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Pro, Ser, Thr и Val, предположительно имеющие внеземное происхождение. Однако в других работах в качестве консенсусного выбран список ранних аминокислот, в котором место Ile занимает Arg. Мы сравнили различия ранних и поздних аминокислот по совокупности их физико-химических свойств (база данных AAindex). Между бинарными списками с Ile и Arg и каждым AA-индексом вычислены точечно-бисериальный коэффициент корреляции r_pb, t- критерий Стьюдента и его достоверности – p-value. Поскольку в общей сложности получено 2 × 553 значений p-value, проблему множественных сравнений решили с помощью коррекции по Бонферрони и метода Бенджамини–Хохберга. Далее мы использовали метод 2B-PLS, который применяется к двум различным наборам признаков, относящихся к одним и тем же объектам, для поиска общей для них информации. В качестве первого набора взяли бинарные списки по Трифонову (Arg) и Вонгу (Ile), в качестве второго – 553 АА-индекса. Максимальную корреляцию и со списком с Ile, и с Arg (1.0 и 0.8 соответственно) продемонстрировал двоичный AA-индекс CHAM830108, характеризующий способность аминокислоты быть донором заряда: поздние аминокислоты способны быть донорами, а ранние – нет. По-видимому, это обусловлено различиями в условиях, в которых протекала эволюция стандартного набора аминокислот: пребиотических и биотических. Из результатов 2B-PLS-анализа тоже следует, что в списке 10 эволюционно ранних аминокислот Ile выглядит предпочтительнее Arg. Подтверждается выделение последних шести аминокислот (Cys, His, Met, Phe, Trp, Tyr), полученное на основании уменьшения зазора HOMO-LUMO, в отдельный, третий этап эволюции набора стандартных аминокислот. Выявлено компактное расположение на 2B-PLS-плоскости физико-химических свойств трех групп аминокислот, у которых во второй позиции кодонов находятся, соответственно, аденин, тимин и цитозин, а также максимальное рассредоточение аминокислот с гуанином во второй позиции кодонов.

МикроРНК в тканях и биологических жидкостях рассматриваются как диагностические биомаркеры и терапевтические мишени многих, в том числе онкологических заболеваний. Особую ценность имеют биомаркеры, присутствующие в легкодоступных биологических жидкостях, в первую очередь, в крови. Потенциал микроРНК как предиктивных онкомаркеров и терапевтических мишеней изучают с использованием глобального профилирования, которое обеспечивается секвенированием нового поколения (NGS). NGS обладает высокой чувствительностью, однонуклеотидным разрешением и позволяет одновременно профилировать большое число образцов. Несмотря на многообещающий потенциал микроРНК как биомаркеров и рост числа работ в этом направлении, недостаточно освещенными остаются проблемы, связанные с методами подготовки образцов, спецификой получения библиотек для секвенирования, сложностями количественного анализа. Подготовка библиотек микроРНК для секвенирования имеет определенные трудности и требует подбора условий для каждого типа биологического материала. В настоящей работе подробно описано приготовление библиотек микроРНК из опухолевой ткани аденомы гипофиза и плазмы крови пациентов с акромегалией для секвенирования на платформе Illumina. Рассмотрены сложности и ограничения методов, а также оценена эффективность секвенирования образцов плазмы и мозга. Работа может служить руководством для исследователей, изучающих механизмы регуляции микроРНК при эндокринных заболеваниях гипофиза, а также позволит адаптировать технические процедуры к разным биологическим образцам и разным патологиям.