CULTIVATION OF MYCELIUM AND THE STUDY OF THE PHYTOPATHOGENICITY OF CERTAIN XYLOTROPHIC BASIDIOMYCETES UNDER IN VITRO CONDITIONS

Full Text

Введение Ксилотрофные базидиомицеты играют важную роль, поскольку являются фитопатогенами хозяйственно ценных лесных культур [2; 12]. Деструкция древесины, которую вызывают эти организмы, приводит к снижению ее качества, что отрицательно сказывается на объеме лесозаготовок [6]. При разрушении древесины наблюдаются изменения как ее физических, так и химических свойств, что в свою очередь приводит к серьезным экономическим потерям [3; 10]. Поэтому требуется серьезный подход в изучении особенностей ростовых процессов и фитопатогенности данной группы базидиомицетов, что позволяют сделать методы, применяемые при культивировании в условиях in vitro. Развитие биотехнологии как прикладной отрасли биологии позволяет выращивать мицелий ксилотрофных базидиомицетов в чистой культуре. Для этой группы организмов отмечено достаточно легкое выделение чистой культуры из природных объектов, быстрый рост на синтетических питательных средах, они не требовательны к богатству элементарного состава питательных сред [4]. Кроме того, методы, применяемые в биотехнологии, позволят изучить фитопатогенность как экологическое явление взаимодействия ксилотрофных базидиомицетов с организмом-хозяином, а именно мелколиственными хозяйственно ценными породами деревьев. Цель работы - изучить особенности культивирования и фитопатогенность мицелия некоторых ксилотрофных базидиомицетов на разных синтетических питательных средах. Материалы и методы исследования В качестве объектов исследования нами были выбраны следующие ксилотрофные базидиомицеты: Fomes fomentarius (L.) Fr., Phellinus igniarius (L.) Quel., Piptoporus betulinus (Bull.) P. Karst., Inonotus obliquus (Ach. ex Pers.) Pil. [1]. Для этой группы организмов характерны макроскопические плодовые тела, которые примыкают одной из сторон к дереву с плотной консистенцией ткани. Для изучения особенностей ростовых процессов мицелия ксилотрофов были использованы методы, которые широко используются в биотехнологии растительных объектов. Плодовые тела были отобраны в березняке и осиннике Костромского, Красносельского и Кологривского районов Костромской области. Для изучения была отобрана центральная мицелиальная часть у молодых плодовых тел F. fomentarius, P. igniarius, P. betulinus, I. obliquus [8; 13]. Проведена дробная стерилизация отобранного материала при следующем режиме: 1) погружение в 70%-ный этанол с экспозицией 1 мин; 2) выдерживание в 3%-ном гипохлорите натрия в течение 15 мин; 3) промывание материала в стерильной дистиллированной воде; 4) экспозиция в стерильной дистиллированной воде в течение 5 мин для окончательного удаления стерилизующего агента. Затем производилась инокуляция мицелия в условиях ламинарного укрытия [7]. Культивирование мицелия ксилотрофных базидиомицетов проводили на специализированной для микобионтов питательной среде Чапека и на среде Мурасиге-Скуга (MS), которая применяется для культивирования растительных объектов (табл. 1) [11; 14]. Таблица 1 Состав питательных сред для культивирования ксилотрофных базидиомицетов Компоненты среды Концентрация веществ, мг/л Компоненты среды Концентрация веществ, мг/л MS Чапека MS Чапека NH4NO3 1 650 - FeSO4·7H2O 27,8 - KNO3 1 900 - Na2ЭДТА·2H2O 37,2 - KH2PO4 170 1 000 Инозитол 100 - CaCl2·2Н2О 340 - Кальция пантотенат 0,5 - MnSO4·4H2O 22,3 - Никотиновая кислота 0,5 - MgSO4 ·H2O 370 500 Тиамин 0,5 1 Н3ВО3 6,2 - Пиридоксин 0,5 - ZnSO4·7H2O 8,6 0,5 Глицин 2 - KI 0,83 - Сахароза 25 000 6 000 CuSO4·5H2O 0,025 - Мальтоза - 4 000 Na2MoO4·2H2O 0,25 Агар «Биолот» 5 000 6 000 CoCl2·6H2O 0,025 pH 5,7 5,7 Также использовались питательные среды MS и Чапека с частями стерильной древесины Betula pendula Roth. и Populus tremula L. для оценки фитопатогенности мицелия [5]. Древесину стерилизовали в сухожаровом шкафу при 160°С 2,5 ч. Культивирование осуществляли на световых стеллажах при интенсивности освещенности 2 500 люкс и температуре 25°С [9]. Результаты культивирования проверялись на 15-20-е сутки. При этом была проведена оценка морфологии и микроскопической структуры мицелия. Стерильный мицелий ксилотрофов был изучен с использованием световой микроскопии (микроскоп «Биомед-3»), увеличение - х600 [15]. Результаты и их обсуждение Наиболее активный рост мицелия наблюдался на питательной среде MS: мицелий от белого до почти черного цвета распространялся как по поверхности питательной среды (P. betulinus), так и проникал вглубь (I. obliquus, F. fomentarius, P. igniarius). Стоит отметить, что рост мицелия P. betulinus на питательной среде начался более интенсивно и в более ранние сроки, чем у других изучаемых ксилотрофов, это можно объяснить более мягкой структурой плодового тела березовой губки. При дальнейшем изучении мицелия отмечался сильный грибной запах, характерный для ксилотрофных базидиомицетов. При этом не было замечено спороношения мицелия (табл. 2). Эти признаки говорят о том, что на питательной среде отмечался именно рост мицелия ксилотрофов, что позволяет исключить контаминацию и идентифицировать культивируемые объекты. Питательная среда Чапека по многим показателям уступала среде MS. В первую очередь отмечался более медленный рост мицелия, а прирост по биомассе на 30-й день культивирования при средних значениях для всех культур также оказался менее продуктивным именно на данной питательной среде (рис. 1). Это, конечно, связано с достаточно бедным содержанием в среде Чапека макро- и микроэлементов, а также некоторых органических веществ, необходимых для развития живых организмов и, в частности, мицелия ксилотрофов. Но это также является и преимуществом при выращивании мицелия в промышленных масштабах (например, для нужд фармацевтической промышленности), так как значительно удешевляет получаемую биомассу вследствие малого расхода компонентов для питательной среды [16]. Рис. 1. Влияние типа питательной среды на прирост биомассы мицелия (среднее значение для всех культур) Проводилась серия опытов по совместному культивированию выделенного мицелия с частями древесины деревьев, к которым данные ксилотрофы проявляли тропность. В дальнейшем с использованием микроскопии изучали морфологию мицелия и проводили оценку его прорастания в древесину. Такое исследование необходимо для определения степени фитопатогенности объекта. Оценку результатов производили через 35-40 суток. Результаты роста, морфологии и микроскопии мицелия были сведены в таблицу (табл. 2). Таблица 2 Сравнительная анатомо-морфологическая характеристика мицелия разных видов ксилотрофных базидиомицетов Оцениваемый признак Анатомо-морфологическая характеристика мицелия Piptoporus betulinus (Bull.) P.Karst., 1881 Особенности роста на питательных средах Мицелий белого цвета распространялся исключительно по поверхности питательной среды, отмечался сильный грибной запах, характерный для данного вида. Спороношения нет Культуральная фитопатогенность Выраженная ксилотропность по отношению к B. pendula. Быстрый экспансивный рост нитей мицелия и ориентация их к древесине Морфология мицелия Мицелий по морфологии слабоветвящийся, септированный, имеет единичные молодые зачатки гиф. Спороношения нет Окончание таблицы 2 Оцениваемый признак Анатомо-морфологическая характеристика мицелия Фитопатогенность для анатомических структур Был выявлен рост мицелия в пробковую и коровую части стебля березы с незначительным проникновением в ксилему. Умеренно выраженная фитопатогенность Inonotus obliquus (Ach. ex Pers.) Pilát (1942) Особенности роста на питательных средах Мицелий темно-коричневого цвета, проникает вглубь питательной среды, характерен медленный рост. Спороношения нет Культуральная фитопатогенность Фитопатогенность выражена слабо, мицелий прорастает в среду медленно, ксилотропность по отношению к B. pendula не выявлена Морфология мицелия Тонкие, умеренно септированные гифы Фитопатогенность для анатомических структур Малопатогенный ксилотроф, за коровую часть стебля гифы гриба не проникают, разрушение древесины не отмечено Fomes fomentarius (L.) Fr., 1849 Особенности роста на питательных средах Мицелий полиморфен от белого до почти черного цвета, гифы располагаются плотно и фрагментарно на поверхности питательной среды. Спороношения нет Культуральная фитопатогенность Ксилотропный рост мицелия выражен умеренно, тенденция к общей экспансии гиф гриба по поверхности питательной среды со слабым проникновением вглубь Морфология мицелия Мицелий слабо септирован, гифы хорошо выражены, плотно переплетены между собой, создавая при этом плотные структуры на поверхности среды Фитопатогенность для анатомических структур Мицелий прорастает в коровый слой и частично внедряется в ксилему Phellinus igniarius (L.) Quél. (1886) Особенности роста на питательных средах Мицелий бесцветен, характерна тонкая мицелиальная структура, которая активно внедряется в субстрат. Спороношения нет Культуральная фитопатогенность Очень высокая, мицелий локализован преимущественно на части древесины, отмечено образование примордия Морфология мицелия Сложная структура, мицелий слабо септирован, гифы окрашены в коричневый цвет, образуют петли и структуры с неустановленным функциональным значением Фитопатогенность для анатомических структур Отмечена крайняя степень патогенности, мицелий полностью разрушает все слои древесины до состояния трухи Особое внимание следует уделить морфологии мицелия и фитопатогенности для анатомических структур, поскольку именно эти параметры во многом определяют взаимодействие ксилотрофных базидиомицетов с организмом-хозяином. Так, например, у I. obliquus отмечается тонкий септированный мицелий и слабое фитопатогенное влияние на структуру древесины при совместном культивировании, поэтому в природных условиях данный ксилотроф практически никогда не встречается на мертвых деревьях (рис. 2). Рис. 2. Культивирование I. obliquus на питательной среде MS (слева), морфология мицелия I. obliquus при микроскопировании с увеличением ×600 (справа) Морфология мицелия P. igniarius отличается мощностью гиф, сложной слабо септированной структурой с петлями и неустановленными элементами, при этом данный ксилотроф отличается исключительной агрессивностью по отношению к древесине Populus tremula L. и при совместном культивировании вызывает не только полное ее разрушение, но и образование примордия (рис. 3). В природе P. igniarius также проявляет высоко патогенные свойства и при заражении дерева приводит к развитию сердцевинной гнили и быстрой гибели дерева. Отмечается также значительное образование плодовых тел. Стоит отметить, что только при культивировании данного ксилотрофного базидиомицета в условиях in vitro удалось получить примордий, что говорит и об агрессивном характере распространения данного фитопатогена. Рис. 3. Культивирование P. igniarius на питательной среде MS и образование примордия на части древесины P. tremula (слева), морфология мицелия P. igniarius при микроскопировании с увеличением ×600 (справа) Что касается таких ксилотрофных базидиомицетов как P. betulinus и F. fomentarius, стоит отметить их умеренную фитопатогенность по отношению к организму-хозяину, в природе эти виды предпочитают селиться на уже погибшие или сильно ослабленные мелколиственные породы и преимущественно на Betula pendula Roth. Что, однако, не говорит о том, что они не способны нанести ущерб лесному хозяйству. Заключение Используя методы, применяемые при клональном микроразмножении растений, удалось получить чистые культуры in vitro ксилотрофных базидиомицетов Fomes fomentarius (L.) Fr., Phellinus igniarius (L.) Quél, Piptoporus betulinus (Bull.) P.Karst., Inonotus obliquus (Ach. ex Pers.) Pilát. Проведено детальное изучение морфологии, анатомии и микроскопического строения мицелия этих объектов, также особое внимание было уделено изучению степени фитопатогенности и ее проявлений для анатомических структур организма-хозяина. Наиболее агрессивным ксилотрофным базидиомицетом оказался P. igniarius, который преимущественно поражает Populus tremula L. Фитопатогены Betula pendula Roth. оказались умеренно или слабопатогенными как по ксилотропности, так и по характеру проникновения в коровую часть и разрушению древесины. Полученные данные позволят лучше понимать особенности взаимодействия паразитических базидиомицетов с организмом-хозяином, а также проливают свет на экологию ксилотрофных базидиомицетов, что в свою очередь можно использовать при проведении лесотехнических и санитарных мероприятий по борьбе с фитопатогенами и для повышения качества древесины, получаемой от мелколиственных пород.

About the authors

E. V Maramokhin

Kostroma State University

M. V Sirotina

Kostroma State University

Dr.habil.

D. N Zontikov

Kostroma State University

Ph.D.

References

Supplementary files