Применение бимолекулярной флуоресцентной комплементации для визуализации гистоновых модификаций в живых клетках

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Эпигенетические модификации гистонов в составе хроматина в клетках человека, животных и других эукариотических организмов играют ключевую роль в регуляции экспрессии генов. Гистоны могут подвергаться разнообразным посттрансляционным модификациям в различных комбинациях (включая метилирование, ацетилирование, фосфорилирование и др.) по различным аминокислотным остаткам, что определяет функциональное состояние данного локуса хроматина. Изменение эпигенетических модификаций сопровождает все нормальные и патологические клеточные процессы, включая пролиферацию, дифференцировку, раковую трансформацию и др. На сегодняшний день особенно актуальны разработка и применение новых методов анализа эпигенома на уровне единичных клеток, в том числе живых клеток. В данной работе были получены новые сенсорные системы для визуализации эпигенетических модификаций H3K9me3 (триметилированный Lys9), H3K9ac (ацетилированный Lys9) и пространственного сближения H3K9me3 c H3K9ac, основанные на флуорогенных красителях. Для создания сенсоров были использованы последовательности белка splitFAST, а также природные ридерные белковые домены MPP8 и AF9. Добавление в клеточную среду флуорогенов HMBR и N871b позволило детектировать ясно различимые паттерны флуоресценции в зеленом и красном каналах соответственно. Нами также был проведен обсчет полученных флуоресцентных изображений с помощью компьютерного метода анализа LiveMIEL (Live-cell Microscopic Imaging of Epigenetic Landscape). Кластеризация полученных данных показала хорошее согласование с предполагаемыми метками классов, соответствующих представленности H3K9me3, H3K9ac и пространственному сближению H3K9me3 и H3K9ac в ядре. Разработанные сенсоры могут быть эффективно использованы для изучения гистоновых модификаций в различных клеточных процессах, а также в исследовании механизмов развития заболеваний.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

А. И. Степанов

Сколковский институт науки и технологии, Центр молекулярной и клеточной биологии; Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: gurskayanadya@gmail.com
Россия, Москва; Москва

Л. В. Путляева

Сколковский институт науки и технологии, Центр молекулярной и клеточной биологии; Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: gurskayanadya@gmail.com
Россия, Москва; Москва

А. А. Шуваева

Московский физико-технический институт

Email: gurskayanadya@gmail.com
Россия, Москва

М. А. Андрушкин

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова

Email: gurskayanadya@gmail.com
Россия, Москва

М. С. Баранов

Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова

Email: gurskayanadya@gmail.com
Россия, Москва; Москва

Н. Г. Гурская

Сколковский институт науки и технологии, Центр молекулярной и клеточной биологии; Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова

Email: gurskayanadya@gmail.com
Россия, Москва; Москва; Москва

К. А. Лукьянов

Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: gurskayanadya@gmail.com
Россия, Москва

Список литературы

  1. Millán-Zambrano G., Burton A., Bannister A.J., Schneider R. // Nat. Rev. Genet. 2022. V. 23. P. 563– 580. https://doi.org/10.1038/s41576-022-00468-7
  2. Yun M., Wu J., Workman J.L., Li B. // Cell Res. 2011. V. 21. P. 564–578. https://doi.org/10.1038/cr.2011.42
  3. Kungulovski G., Kycia I., Tamas R., Jurkowska R.Z., Kudithipudi S., Henry C., Reinhardt R., Labhart P., Jeltsch A. // Genome Res. 2014. V. 24. P. 1842–1853. https://doi.org/10.1101/gr.170985.113
  4. Mauser R., Kungulovski G., Keup C., Reinhardt R., Jeltsch A. // Epigenetics Chromatin. 2017. V. 10. P. 45. https://doi.org/10.1186/s13072-017-0153-1
  5. Delachat A.M.-F., Guidotti N., Bachmann A.L., Meireles-Filho A.C.A., Pick H., Lechner C.C., Deluz C., Deplancke B., Suter D.M., Fierz B. // Cell Chem. Biol. 2018. V. 25. P. 51–56.e6. https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2017.10.008
  6. Villaseñor R., Pfaendler R., Ambrosi C., Butz S., Giuliani S., Bryan E., Sheahan T.W., Hélène D. // Nat. Biotechnol. 2020. V. 38. P. 728–736. https://doi.org/10.1038/s41587-020-0434-2
  7. Stepanov A.I., Shuvaeva A.A., Putlyaeva L.V., Lukyanov D.K., Galiakberova A.A., Gorbachev D.A., Maltsev D.I., Pronina V., Dylov D.V., Terskikh A.V., Lukyanov K.A., Gurskaya N.G. // Cell Mol. Life Sci. 2024. V. 81. P. 381. https://doi.org/10.1007/s00018-024-05359-0
  8. Müller I., Moroni A.S., Shlyueva D., Sahadevan S., Schoof E.M., Radzisheuskaya A., Højfeldt J.W., Pedersen D.S., Trifonov M., Mikkelsen J.G. // Nat. Commun. 2021. V. 12. P. 3034. https://doi.org/10.1038/s41467-021-23308-4
  9. Ng A.H.M., Khoshakhlagh P., Rojo Arias J.E., Pasquini G., Wang K., Swiersy A., Shipman S.L., Tian C., Miller D.M. // Nat. Biotechnol. 2021. V. 39. P. 510–519. https://doi.org/10.1038/s41587-020-0742-6
  10. Tebo A.G., Gautier A. // Nat. Commun. 2019. V. 10. P. 2822. https://doi.org/10.1038/s41467-019-10855-0
  11. Plamont M.-A., Billon-Denis E., Maurin S., Gauron C., Pimenta F.M., Specht C.G., Shi J., Lamberti A., Carlier A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2016. V. 113. P. 497–502. https://doi.org/10.1073/pnas.1513094113
  12. Povarova N.V., Zaitseva S.O., Baleeva N.S., Smirnov A.Y., Myasnyanko I.N., Zagudaylova M.B., Bozhanova N.G., Yegorov A.Y., Mikhaylov A.D. // Chemistry. 2019. V. 25. P. 9592–9596. https://doi.org/10.1002/chem.201901151
  13. Benaissa H., Ounoughi K., Aujard I., Fischer E., Goïame R., Nguyen J., Tebo A.G., Pimentel C., Nicolas C. // Nat. Commun. 2021. V. 12. P. 6989. https://doi.org/10.1038/s41467-021-27334-0
  14. Padeken J., Methot S.P., Gasser S.M. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2022. V. 23. P. 623–640. https://doi.org/10.1038/s41580-022-00483-w
  15. Gates L.A., Shi J., Rohira A.D., Feng Q., Zhu B., Bedford M.T., Sagum C.A., Hewitt M.J., Cai Z. // J. Biol. Chem. 2017. V. 292. P. 14456–14472. https://doi.org/10.1074/jbc.m117.802074
  16. Kokura K., Sun L., Bedford M.T., Fang J. // EMBO J. 2010. V. 29. P. 3673–3687. https://doi.org/10.1038/emboj.2010.239
  17. Li Y., Wen H., Xi Y., Tanaka K., Wang H., Peng D., Ren Y., Li Z., Liu C. // Cell. 2014. V. 159. P. 558–571. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.09.049
  18. Stepanov A.I., Besedovskaia Z.V., Moshareva M.A., Lukyanov K.A., Putlyaeva L.V. // Int. J. Mol. Sci. 2022. V. 23. P. 8988. https://doi.org/10.3390/ijms23168988
  19. Stepanov A.I., Zhurlova P.A., Shuvaeva A.A., Sokolinskaya E.L., Gurskaya N.G., Lukyanov K.A., Putlyaeva L.V. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2023. V. 687. P. 149174. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2023.149174
  20. Pedregosa F., Varoquaux G., Gramfort A., Michel V., Thirion B., Grisel O., Blondel M., Linh H., Poggio T. // J. Machine Learning Res. 2012. V. 12. P. 2825–2830. https://doi.org/10.48550/arXiv.1201.0490

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Флуоресцентная микроскопия клеток HEK293T, трансфицированных сенсорами MPP8-FAST-NLS-MPP8 и AF9-FAST-NLS-AF9 (NLS для удобства убран из надписей на рисунках). Флуороген – HMBR.

Скачать (74KB)
Метаданные
3. Рис. 2. (а) – Список созданных плазмид, разбитый по группам. Звездочка указывает на внесение мутаций MPP8 W80A и AF9 Y78A в соответствующие последовательности ДНК; (б) – флуоресцентная микроскопия котрансфицированных различными вариантами плазмид в клетки НЕК293T. Флуороген – HMBR; (в) – флуоресцентная микроскопия котрансфицированных плазмид в клетках НЕК293T в двух каналах, над изображениями указаны использованные флуорогены; NLS для удобства убран из надписей на рисунках.

Скачать (196KB)
Метаданные
4. Рис. 3. (а) – Флуоресцентная микроскопия клеток HEK293T, экспрессирующих MPP8-FAST-NLS-AF9. Флуороген – HMBR; (б) – флуоресцентная микроскопия клеток HEK293Т, экспрессирующих различные комбинации плазмид системы splitFAST. Флуороген – HMBR. Звездочка указывает на то, что домены имеют мутацию MPP8 W80A и AF9 Y78A; (в) – флуоресцентная микроскопия HEK293 AF9-NFAST-NLS и MPP8-CFAST11-NLS в двух каналах, над изображениями указаны использованные флуорогены. NLS для удобства убран из надписей на рисунках.

Скачать (199KB)
Метаданные
5. Рис. 4. (а) – Анализ эпигенетических модификаций H3K9me3, H3K9ac и H3K9me3-H3K9ac методом LiveMIEL. Сегментированные ядра клеток HEK293T, экспрессирующие MPP8-NFAST + MPP8-CFAST11, AF9-NFAST + AF9-CFAST11 и AF9-NFAST + MPP8-CFAST11; (б) – анализ текстурных особенностей, извлеченных из одиночных изображений ядер, методом главных компонент (PCA) (значения признаков были усреднены по n = 40 ядер); (в) – значения коэффициента силуэта si для EM-кластеризации данных PCA (n = 3). Красная линия соответствует среднему значению коэффициента силуэта s = 0.31 в наборе данных; (г) – визуализация кластеризации EM для n = 3 кластеров. Точки представляют текстурные особенности, полученные на основе изображений, визуализирующих представленность H3K9me3, H3K9ac и H3K9me3-H3K9ac в ядрах. NLS для удобства убран из надписей на рисунках.

Скачать (175KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025