The high cellular level of cyclic di-adenosine monophosphate (c-di-AMP), which in turn results in resistance to cell-wall targeted antibiotics in Staphylococcus aureus. An increase in intracellular molecules of c-di-AMP is due to mutations in the DHH/DHHA1 domain of the GdpP protein. The influence of mutations in the other domains of GdpP has not been fully studied. The aim of this study was to obtain a targeted non-frameshifting deletion in the GdpP protein’s linker region between the GGDEF and DHH/DHHA1 domains. Restriction-modification deficient strain S. aureus RN4220 was used for genome editing. Two vectors with thermosensitive origins of replication were used. The first pCN-EF2132tet vector contained the Enterococcus faecalis EF2132 recombinase gene; the second pCAS9counter vector contained the Streptococcus pyogenes RNA-directed Cas9 nuclease gene. The S. aureus RN4220 strain was transformed with the pCN-EF2132tet vector to obtain recombining competent cells, and then a donor oligonucleotide was introduced simultaneously with the counterselection vector. A recombinant strain with a target deletion (90 bp) in GdpP (amino acids 308–337) was obtained after two sequential transformations. The mutant strain showed no changes in the phenotype: lag phase, growth rate, doubling time, and colony morphology did not differ from the progenitor strain. Susceptibility to cell-wall targeted antibiotics was the same as in the progenitor strain. Thus, mutations in the linker region between the GGDEF and DHH/DHHA1 domains of the GdpP do not affect susceptibility to antibiotics in S. aureus.
Высокие внутриклеточные концентрации молекул циклического ди-аденозинмонофосфата (c-di-AMP) влияют на формирование устойчивости к антибиотикам, действующих на клеточную стенку у Staphylococcus aureus. Накопление молекул c-di-AMP происходит вследствие мутаций в домене DHH/DHHA1 белка GdpP. Роль мутаций в других доменах GdpP до конца не изучена. В этой связи целью настоящей работы стало получение направленной делеции в геноме без сдвига рамки считывания в линкерном участке между доменами GGDEF и DHH/DHHA1 белка GdpP. Для редактирования генома использовали штамм S. aureus RN4220 с отсутствующей системой рестрикции-модификации. Использовали двух векторную систему с термочувствительными ориджинами репликации, плазмиды: pCN-EF2132tet с геном рекомбиназы EF2132 Enterococcus faecalis и pCAS9counter с геном РНК-направляемой нуклеазы Cas9 Streptococcus pyogenes. Штамм S. aureus RN4220 трансформировали вектором pCN-EF2132tet для получения рекомбинирующих компетентных клеток, а затем вводили донорный олигонуклеотид одновременно с вектором контрселекции. После двух трансформаций был получен штамм с целевой делецией (90 пн), которая соответствовала 308–337 аминокислотному участку в белке GdpP. У мутантного штамма не было выявлено фенотипических изменений: ЛАГ-фаза роста, общая скорость роста, время деления клеток, морфология колоний не отличались от исходного штамма. Также сохранялась чувствительность к антибиотикам, действующим на клеточную стенку. Таким образом, мутации в GdpP в линкерном участке между GGDEF и DHH/DHHA1 не влияют на чувствительность к антибиотикам у S. aureus.