Single nucleotide polymorphism (SNP) is a change of one nucleotide by another. This change often leads to an emergence (or disappearance) of a site recognized by a certain restriction endonuclease. As a result amplification of DNA fragment using primers surrounding SNP point (containing either N1 or N2 nucleotide) followed by hydrolysis of the amplicon with this restriction enzyme will be different for three possible variants in a diploid genome (genotypes N1/N1, N1/N2 and N2/N2). This method of restriction fragments length polymorphism (RFLP) is widely used in the genetic studies. Earlier we have developed GlaI- and FatI-PCR analyses methods which allowed to carry out real-time PCR and showed it applicability for SNP determination. In the current work a new way to determine the single nucleotide polymorphism G/C by the Bst2UI-PCR analysis is proposed. GlaI- and Bst2UI-PCR analyses have been used to determine the frequency of G/C polymorphism variants at the chr20:37352001 position (according to GRCH38.p14 genomic assembly) in the blood DNA samples of 161 donors. The study included: 1) the isolation of leukocyte DNA from blood cells; 2) GlaI- and Bst2UI-PCR analyses of the DNA fragment chr20:37351957-37352083, 3) determination of cytosine and guanine at the chr20:37352001 position in the analyzed DNA preparations, and 4) comparative analysis of the obtained results. It has been shown that 68 donors (42.2%) have a heterozygous set of G/C at the chr20:37352001 position, 89 donors (55.3%) are homozygous by G, and 4 donors (2.5%) are homozygous by C. Thus, taking into account that blood cells have a diploid set of chromosomes, G to C replacement occurs in 76 out of 322 analyzed cases (23.6%). At the same time, from the results obtained it follows that the cytosine residue complementary to G at the chr20:37352001 position exists in methylated form (5-methylcytosine) in most of the DNA molecules, both in homo- and heterozygotes. The proposed method of Bst2UI-PCR analyses extends the possibilites of SNP determination using real-time PCR.
Однонуклеотидный полиморфизм (SNP) заключается в замене одного нуклеотида на другой, что часто приводит к возникновению (или исчезновению) сайта узнавания определенной рестриктазы. В результате при амплификации фрагмента ДНК с праймеров, окружающих точку SNP (содержащую либо N1, либо N2-нуклеотид), и последующего гидролиза ампликона данной рестриктазой картины расщепления ДНК будут разные для трех возможных вариантов в диплоидной ДНК (генотипы N1/N1, N1/N2 и N2/N2). Данный метод определения полиморфизма длин фрагментов рестрикции (RFLP) широко используется в практике генетических исследований. Ранее мы разработали методы GlaI- и FatI-ПЦР анализа, в которых проводится ПЦР в реальном времени вместо электрофореза, и показали его применимость для определения SNP T/C. В настоящей работе предложен новый способ определения однонуклеотидного полиморфизма G/C методом Bst2UI-ПЦР анализа. GlaI- и Bst2UI-ПЦР анализ использовали для определения частоты вариантов полиморфизма G/C в положении хр20:37352001 (по геномной сборке GRCh38.p14) в препаратах ДНК, выделенной из клеток крови 161 человека. Исследование включало: 1) выделение лейкоцитарной ДНК из клеток крови; 2) проведение GlaI- и Bst2UI-ПЦР анализа фрагмента ДНК хр20:37351957–37352083; 3) определение цитозина и гуанина в позиции хр20:37352001 в анализируемых препаратах ДНК; 4) сравнительный анализ полученных результатов. Показано, что 68 доноров (42.2%) имеют гетерозиготный набор G/C в положении хр20:37352001, 89 доноров (55.3%) гомозиготны по G, а четыре донора (2.5%) – по C. Таким образом, принимая во внимание, что клетки крови имеют диплоидный набор хромосом, замена G на C встречается в 76 из 322 проанализированных вариантов (23.6%). При этом из полученных результатов следует, что цитозин, комплементарный G в положении хр20:37352001, в большей части молекул ДНК находится в метилированной форме (5-метилцитозин) как у гомо-, так и у гетерозигот. Предложенный метод Bst2UI-ПЦР анализа расширяет возможности определения SNP с помощью ПЦР в реальном времени.