Russian Journal of GeneticsRussian Journal of GeneticsГенетика0016-67583034-5103The Russian Academy of Sciences66689210.31857/S0016675823020108KYDKCDГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКАCharacterization of Novel F5 Intronic Variant Associated with Aberrant Splicing and Severe Factor V DeficiencyХарактеристика нового интронного варианта в гене F5, ассоциированного с аберрантным сплайсингом и тяжелой формой наследственного дефицита фактора VPshenichnikovaO. S.ПшеничниковаО. С.pshenichnikovaolesya@gmail.comYakovlevaE. V.ЯковлеваЕ. В.pshenichnikovaolesya@gmail.comZozulyaN. I.ЗозуляН. И.pshenichnikovaolesya@gmail.comPoznyakovaYu. M.ПозняковаЮ. М.pshenichnikovaolesya@gmail.comDemidovaE. Yu.ДемидоваЕ. Ю.pshenichnikovaolesya@gmail.comSurinV. L.СуринВ. Л.pshenichnikovaolesya@gmail.comNational Medical Research Center for HematologyНациональный медицинский исследовательский центр гематологии0102202359220921626022025Copyright ©; 2023, О.С. Пшеничникова, Е.В. Яковлева, Н.И. Зозуля, Ю.М. Познякова, Е.Ю. Демидова, В.Л. СуринCopyright ©; 2023, О.С. Пшеничникова, Е.В. Яковлева, Н.И. Зозуля, Ю.М. Познякова, Е.Ю. Демидова, В.Л. Сурин2023О.С. Пшеничникова, Е.В. Яковлева, Н.И. Зозуля, Ю.М. Познякова, Е.Ю. Демидова, В.Л. СуринО.С. Пшеничникова, Е.В. Яковлева, Н.И. Зозуля, Ю.М. Познякова, Е.Ю. Демидова, В.Л. Суринhttps://transsyst.ru/0016-6758/article/view/666892

Congenital factor V deficiency is a rare autosomal recessive bleeding disorder, caused by defects in F5 gene and associated with bleeding manifestations of variable severity. In this study we report molecular and functional characterization of a novel F5 variant which causes aberrant splicing and significantly reduces protein expression in a patient with severe FV deficiency. We performed F5 mutation screening and functional study in a proband (FV:C 0.4%) with a history of gastrointestinal bleeding, post-traumatic bleeding, hematomas, ecchymoses, and discomfort in ankle joints since infancy. Sequencing revealed a novel homozygous F5 gene variant NC_000001.10:169519985G>C (or NM_000130.5:c.1297 –8C>G). Bioinformatics sequence analysis predicted that this variant would lead to the acceptor site loss of the intron 8/exon 9 junction. However mRN-A analysis identified, that it also activated the aberrant splice site located 7 nucleotides upstream of the normal one and was associated with the production of an anomalous F5 transcript with retention of seven nucleotides of intron 8 resulting in a premature stop codon. We revealed no traces of normal transcript in the patient. Our findings confirm that not only changes in canonical splicing dinucleotides could significantly disrupt the splicing sites and impair pre-mRNA processing.

Наследственный дефицит фактора свертывания крови V (FV) – это редкое аутосомное наследственное заболевание, которое вызывается дефектами в гене F5 и проявляется кровотечениями разной степени тяжести. Цель данного исследования – молекулярная и функциональная характеристика нового варианта гена F5, приводящего к аберрантному сплайсингу и предельному снижению активности белка, выявленного у пациента с тяжелой формой дефицита FV. Были проведены мутационный скрининг гена F5 и функциональное исследование для пробанда (FV:C 0.4%), с детства страдающего желудочно-кишечными и посттравматическими кровотечениями, гематомами, экхимозами и дискомфортом в голеностопных суставах. Секвенирование выявило наличие нового гомозиготного варианта гена F5 NC_000001.10:169519985G>C (или NM_000130.5:c.1297 –8C>G). По результатам биоинформатического анализа данный вариант должен приводить к потере акцепторного сайта на границе интрона 8 и экзона 9. Однако анализ мРНК FV показал, что помимо этого он активирует аберрантный сайт сплайсинга на дистанции в семь нуклеотидов от сайта дикого типа и приводит к образованию аномального транскрипта, в котором остается семь нуклеотидов от интрона 8 и формируется преждевременный стоп-кодон. Нормальный транскрипт у исследуемого пациента не выявлялся. Результаты данного исследования свидетельствуют в пользу того, что изменения не только в канонических динуклеотидах сайтов сплайсинга могут в значительной мере нарушать процессинг пре-мРНК.

aberrant splicingcoagulation factor Vfactor V deficiencyF5 geneintronic variantsmRNA analysis.аберрантный сплайсингфактор свертывания крови Vдефицит фактора свертывания крови Vген F5интронные вариантыанализ мРНК.Mann K.G., Kalafatis M. Factor V: A combination of Dr Jekyll and Mr Hyde // Blood. 2003. V. 101. P. 20–30. https://doi.org/10.1182/blood-2002-01-0290Duga S., Asselta R., Tenchini M.L. Coagulation factor V // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004. V. 36. P. 1393–1399. https://doi.org/10.1016/j.biocel.2003.08.002Paraboschi E.M., Menegatti M., Peyvandi F. et al. Understanding the impact of aberrant splicing in coagulation factor V deficiency // Int. J. Mol. Sci. 2019. V. 20. № 4. P. 910. https://doi.org/10.3390/ijms20040910Paraboschi E.M., Menegatti M., Rimoldi V. et al. Profiling the mutational landscape of coagulation factor V deficiency // Haematologica. 2020. V. 105. № 4. P. e180–e185. https://doi.org/10.3324/haematol.2019.232587Tabibian S., Shiravand Y., Shams M. et al. A comprehensive overview of coagulation factor V and congenital factor V deficiency // Semin. Thromb. Hemost. 2019. V. 45. № 5. P. 523–543. https://doi.org/10.1055/s-0039-1687906Asselta R., Tenchini M.L., Duga S. Inherited defects of coagulation factor V: The hemorrhagic side // J. Thromb. Haemost. 2006. V. 4. № 1. P. 26–34. https://doi.org/10.1111/j.1538-7836.2005.01590.xPeyvandi F., Duga S., Akhavan S., Mannucci P.M. Rare coagulation deficiencies // Haemophilia. 2002. V. 8. № 3. P. 308–321. https://doi.org/10.1046/j.1365-2516.2002.00633.xNuzzo F., Bulato C., Nielsen B.I. et al. Characterization of an apparently synonymous F5 mutation causing aberrant splicing and factor V deficiency // Haemophilia. 2015. V. 21. № 2. P. 241–248. https://doi.org/10.1111/hae.12554Dall’Osso C., Guella I., Duga S. et al. Molecular characterization of three novel splicing mutations causing factor V deficiency and analysis of the F5 gene splicing pattern // Haematologica. 2008. V. 93. № 10. P. 1505–1513. https://doi.org/10.3324/haematol.12934Castoldi E., Duckers C., Radu C. et al. Homozygous F5 deep-intronic splicing mutation resulting in severe factor V deficiency and undetectable thrombin generation in platelet-rich plasma // J. Thromb. Haemost. 2011. V. 9. № 5. P. 959–968. https://doi.org/10.1111/j.1538-7836.2011.04237.xGuella I., Paraboschi E.M., van Schalkwyk W.A. et al. Identification of the first Alu-mediated large deletion involving the F5 gene in a compound heterozygous patient with severe factor V deficiency // Thromb. Haemost. 2011. V. 106. № 2. P. 296–303. https://doi.org/10.1160/TH11-03-0149Kuang S.Q., Hasham S., Phillips M.D. et al. Characterization of a novel autosomal dominant bleeding disorder in a large kindred from east Texas // Blood. 2001. V. 97. № 6. P. 1549–1554. https://doi.org/10.1182/blood.v97.6.1549Lunghi B., Pinotti M., Maestri I. et al. Evaluation of factor V mRNA to define the residual factor V expression levels in severe factor V deficiency // Haematologica. 2008. V. 93. № 3. P. 477–478. https://doi.org/10.3324/haematol.11952Asselta R., Montefusco M.C., Duga S. et al. Severe factor V deficiency: Exon skipping in the factor V gene causing a partial deletion of the C1 domain // J. Thromb. Haemost. 2003. V. 1. № 6. P. 1237–1244. https://doi.org/10.1046/j.1538-7836.2003.00160.xvan Wijk R., Nieuwenhuis K., van den Berg M. et al. Five novel mutations in the gene for human blood coagulation factor V associated with type I factor V deficiency // Blood. 2001. V. 98. № 2. P. 358–367. https://doi.org/10.1182/blood.v98.2.358Desmet F.O., Hamroun D., Lalande M. et al. Human Splicing Finder: An online bioinformatics tool to predict splicing signals // Nucl. Acids Res. 2009. V. 37. P. e67. https://doi.org/10.1093/nar/gkp215Hebsgaard S.M., Korning P.G., Tolstrup N. et al. Splice site prediction in Arabidopsis thaliana pre-mRNA by combining local and global sequence information // Nucl. Acids Res. 1996. V. 24. P. 3439–3452. https://doi.org/10.1093/nar/24.17.3439Reese M.G., Eeckman F.H., Kulp D., Haussler D. Improved splice site detection in Genie // J. Comput. Biol. 1997. V. 4. P. 311–323. https://doi.org/10.1089/cmb.1997.4.311Jaganathan K., Kyriazopoulou Panagiotopoulou S., McRae J.F. et al. Predicting splicing from primary sequence with deep learning // Cell. 2019. V. 176. № 3. P. 535–548. e24. https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.12.015Richards S., Aziz N., Bale S. et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: A joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology // Genet. Med. 2015. V. 17. № 5. P. 405–424. https://doi.org/10.1038/gim.2015.30Hug N., Longman D., Cáceres J.F. Mechanism and regulation of the nonsense-mediated decay pathway // Nucl. Acids Res. 2016. V. 44. № 4. P. 1483–1495. https://doi.org/10.1093/nar/gkw010Schrijver I., Koerper M.A., Jones C.D., Zehnder J.L. Homozygous factor V splice site mutation associated with severe factor V deficiency // Blood. 2002. V. 99. P. 3063–3065. https://doi.org/10.1182/blood.v99.8.3063Fu Q.H., Zhou R.F., Liu L.G. et al. Identification of three F5 gene mutations associated with inherited coagulation factor V deficiency in two Chinese pedigrees // Haemophilia. 2004. V. 10. P. 264–270. https://doi.org/10.1111/j.1365-2516.2004.00896.x